METODE STERILISASI EKSPLAN TANAMAN

Dalam kultur jaringan, inisiasi kultur yang bebas dari kontaminan merupakan langkah yang sangat penting, karena tanaman yang dari lapang mengandung debu, kotoran-kotoran dan berbagai kontaminan hidup pada permukaannya. Kontaminan hidup dapat berupa cendawan, bakteri, serangga dan telurnya, tungau serta spora-spora. Bila sumber kontaminan ini tidak dihilangkan, maka pada media yang me-ngandung gula, vitamin dan mineral akan ditumbuhi oleh jamur dan bakteri. Apabila eksplan terkontaminasi, maka akan mati oleh persenyawaan beracun yang di produksi dan dikeluarkan oleh bakteri atau jamur.

Pada beberapa tanaman, ditemukan juga kontaminan yang berasal dari dalam jaringan tanaman, terutama bakteri. Kontaminan internal ini sangat sulit diatasi, karena sterilisasi permukaan tidak menyelesaikan masalah. Pada bahan tanaman yang mengandung kontaminan internal, harus diberi perlakuan antibiotik atau bakterisida yang sistemik.

Tiap bahan tanaman mempunyai tingkat kontaminasi permukaan yang ber-beda-beda, tergantung dari :

1. Jenis tanamannya
2. Bagian tanaman yang dipergunakan
3. Morfologi permukaan (ex. Berbulu atau tidak)
4. Lingkungan tumbuhnya (green house atau lapangan)
5. Musim waktu mengambil (musim hujan atau kemarau)
6. Umur tanaman (seedling atau tanaman dewasa)
7. Kondisi tanamannya (sehat atau sakit)

Keadaan ini menyukarkan penentuan suatu prosedur sterilisasi standart yang berlaku untuk semua tanaman. Juga sukar untuk menentukan prosedur standart yang dapat digunakan untuk suatu jenis tanaman yang berasal dari tempat yang berbeda. Prosedur sterilisasi setiap tanaman harus ditentukan melalui percobaan pendahuluan.

 

Dalam sterilisasi bahan tanaman, hal yang penting yang harus mendapat perhatian adalah; bahwa sel tanaman dan kontaminan adalah sama-sama benda hidup. Kontaminan harus dihilangkan tanpa mematikan sel tanaman.

Beberapa jenis bahan disenfektan yang dapat digunakan untuk sterilisasi bahan tanaman :

No	Bahan	Konsentrasi	Lama perendaman
1	Kalsium hipoklorit	1 – 10 %	5 – 30 menit
2	Natrium hipoklorit	1 – 2 %	7 – 15 menit
3	Hidrogen peroksida	3 – 10 %	5 – 15 menit
4	Perak nitrat	1 %	5 – 30 menit
5	Merkuri klorit (HgCl2)	0.1 – 0.2 %	10 – 20 menit
6	Bethadine	2.5 – 10 %	5 – 10 menit
7	Fungisida	2 g/l	20 – 30 menit
8	Antibiotik	50 – 100 mg/l	½ - 1 jam
9	Alkohol	70 %	1 – 10 menit
10	Bayclin/sunclin	5 – 30 %	5 – 25 menit

Bahan-bahan sterilisasi ini pada umumnya bersifat toxic/racun terhadap jaringan tanaman. Pembilasan yang berkali-kali sesudah perendaman eksplan di dalam larutan bahan streilisasi, sangat diperlukan untuk menghilangkan sisa-sisa bahan aktif yang masih menempel dipermukaan bahan tanaman.

Dalam sterilisasi, kadang-kadang digunakan dua atau lebih bahan sterilisasi. Misalnya; perendaman dalam alkohol dulu, kemudian dalam bayclin, setelah itu bilas dengan air steril. Dapat juga perendaman di mulai dengan larutan fungisida atau antibiotik, kemudian baru HgCl₂ dan dibilas dengan air steril. Prosedur mana yang efektif, harus ditentukan melalui percobaan pendahuluan.

Sterilisasi bahan tanaman dimulai dengan pencucian dan pembuangan bagian-bagian yang kotor dan mati di bawah pancuran air bersih. Pencucian dapat dilakukan dengan penyikatan menggunakan detergent halus. Kadang-kadang bahan yang sudah bersih dibiarkan dibawah pancuran air selama 30 menit. Hal ini dilakukan untuk memecah koloni kontaminan yang masih menempel dipermukaan agar koloni tersebut lebih peka terhadap bahan-bahan sterilisasi. Juga untuk mengurangi dan menghilangkan senyawa fenol, terutama pada tanaman yang kandungan fenoliknya tinggi.

Bahan yang sudah bersih dikecilkan sampai ukuran tertentu. Ukuran ini harus lebih besar dari ukuran eksplan yang direncanakan. Bahan kemudian direndam dalam larutan fungisida/antibiotik. Setelah waktu perendaman tercapai, bahan dicuci bersih dan ditiriskan, kemudian bawa masuk ke dalam laminar. Di dalam laminar eksplan direndam dalam alkohol 70 % selama 1 – 2 menit, dan dibilas dengan air steril sekali. Kemudian rendam eksplan dalam larutan bayclin 20 % + tween-20 2 tetes selama 10 menit. Tween-20 ini berfungsi sebagai perekat. Setelah waktu pe-rendaman tercapai, eksplan dibilas dengan air steril 3 – 5 kali selama 5 menit untuk tiap-tiap pembilasan dan letakkan di dalam petridish yang dialasi tissue steril. Bila semua prosedur sudah dilakukan, berarti bahan tanaman sudah siap di tanam pada media kultur.

Prosedur sterilisasi dapat dimodifikasi sesuai dengan kebutuhan, seperti :

1. Fungisida – alkohol – bayclin – bayclin – aquades steril
2. Alkohol – bayclin – bayclin – aquades steril
3. HgCl₂ – alkohol – aquades steril
4. Fungisida – bayclin – bayclin – bayclin – aquades steril
5. dll